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中山市飞步脚轮有限公司
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金钻脚轮电泳技术-中山市飞步脚轮有限公司

金钻脚轮电泳技术


发表时间:8:13:41

 

 

五种金钻脚轮电泳技术的比较
SDSPAGE
  名词解释:
  相对迁移率(Rf)
  问答题:
  1.简述SDS-PAGE的基本原理。
  2.影响SDS金钻脚轮电泳的关键因素有哪些?  AGE
 名词解释
1.迁移率
2.电渗
3.金钻脚轮电泳
 问答题
1.影响金钻脚轮电泳迁移率的因素有哪些?
2.试述琼脂糖凝胶金钻脚轮电泳分离脂蛋白的原理。 CAME
1.CAME的基本原理是什么?
2.CAME分离血清蛋白金钻脚轮电泳时应注意哪些问题? PAGE
名词解释
1.凝胶总浓度
2.交联度
问答题
1.与CAME相比,PAGE有哪些特点。
2.试比较CAME与PAGE操作的区别。
3.简述不连续PAGE的原理。 
1.琼脂糖凝胶金钻脚轮电泳Agarose Gel Electrophoresis
 Gel Electrophoresis :由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的金钻脚轮电泳。
 特点(characteristic):
1.可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中泳动。 
2. 金钻脚轮电泳操作方法简便,金钻脚轮电泳速度快。
3. 分辨率高,重复性好,金钻脚轮电泳图谱清晰。
4. 适用于生化,免疫等定性定量测定。
(一)优点(advantage)
1.因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗。
2.对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。
3.凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。
4.透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。
5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量测定。
6.有热可逆性。
(二)缺点(disadvantage)
1.机械强度差,易破碎,浓度不能太低。
2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,金钻脚轮电泳后必须立即固定染色。
4.与PAGE相比,分子筛(molecular sieve)作用小,区带少。 
应用
1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化
2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测
3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标
  影响迁移的因素
 
琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白
原理:      血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后,以琼脂糖凝胶为支持介质,在pH8.6巴比妥缓冲液中金钻脚轮电泳,根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。
 pH 8.6 > pI ,各种脂蛋白均带负电,金钻脚轮电泳时由负极到正极;VLDL为圆形,受阻力小,LDL形态不规则,受阻力大,所以VLDL跑在前。
加样槽在负极,由负极到正极分别是CM\LDL\VLDL\HDL
2.醋酸纤维薄膜金钻脚轮电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis,CAME
特点:低吸附作用,低电渗作用,样本用量少,亲水性
1.Low sorption
2.Low electroosmosis 
3.Small sample
4.Hydrophilic 
金钻脚轮电泳图谱不齐
①点样时血清点加不均匀
②薄膜局部干燥
③金钻脚轮电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少
④缓冲液变质
⑤金钻脚轮电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 
金钻脚轮电泳图谱分理不清
①点样时血清点加不均匀
②薄膜局部干燥
③金钻脚轮电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少
④缓冲液变质
⑤金钻脚轮电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行 
金钻脚轮电泳速度慢
1. 浓缩效应
1)凝胶层的不连续性
  两层凝胶T与C不同孔径不同
  浓缩胶孔径大,分离胶孔径小,蛋白质在大孔径浓缩胶中移动,受阻力小,移动速度快。
 2)缓冲液离子成分的不连续性
甘氨酸(pI=6.0)在pH8.3带负电,朝正极移动,进入浓缩胶(pH6.7),甘氨酸解离度()很小,有效迁移率(M )很低,移动速度较慢,称为慢离子。
HCl 是强电解质,=1,Cl-有效迁移率大,移动速度快,称快离子。
蛋白质(pI<6.0)带负电荷,有效迁移率介于两者之间。 
3)pH值的不连续性
     为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率,必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。
3.分子筛效应与电荷效应
    进入分离胶后,Gly-成为快离子
    分离胶只有电荷效应和分子筛效应,根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离
PAGE特点
1.具有分子筛效应,分辨率高
2.样品不易扩散,用量少,灵敏度可达10-6g
3.化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团
4.凝胶不带电荷,消除了电渗现象
5.机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内无色透明
6.网孔可调节  4.SDSPAGE
十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)
是一种阴离子去污剂(anionic detergent )。
? 作用:破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性
(denature)而改变原有的构象;
? 保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
原理

 
 电流过低
 供给薄膜的液量不足
 缓冲液离子强度过高
 薄膜中杂质 
白蛋白区带中间部分不着色,染色不足
染色时间不够、点样过多
γ球蛋白向反方向移动
电渗现象,可提高缓冲液液面或加大电流量以改进
区带一边长一边短呈扭曲现象
薄膜未紧压在金钻脚轮电泳槽的滤纸桥上,使薄膜接触不良而增大了电阻。 
区带拖尾或区带过于紧密
缓冲液离子强度<0.05可出现区带拖尾;离子强度>0.075可出现区带过于紧密。
血清蛋白质醋酸纤维薄膜金钻脚轮电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis
[原理] CAME是以醋纤膜(CAM)作支持物的一种区带金钻脚轮电泳技术。
      将血清样品点样于醋纤膜上,在pH8.6的缓冲液中金钻脚轮电泳时,血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等,加之分子大小和形状各异,因而金钻脚轮电泳迁移率不同,彼此得以分离。加样:用加样器蘸取血清约5ul,垂直印在CAM粗糙面,点样区距离边缘约1.5cm,金钻脚轮电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15V/cm膜总宽。金钻脚轮电泳40~60分钟,泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。
由负极到正极可分为五条条带
γ β α2 α1 白蛋白
3.聚丙烯酰胺凝胶金钻脚轮电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE
        PAG是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体和N,N'-亚甲双丙烯酰胺(N,N,N',N'-methylene bisacrylamide,Bis)交联剂通过自由基( free radicals)聚合而成的一种多孔三维网状结构。
    过硫酸胺[(NH4)2S2O8](Ammonium persulfate,AP)作为催化剂,四甲基乙二胺(-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED)为加速剂。 
?TEMED量多少都会影响催化作用,须在碱性条件下聚合
  -分子氧存在,聚合不完全,须去除分子氧,隔绝氧
  ?升高温度能提高聚合,降低温度能延迟聚合
PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小,选择合适的单体浓度。
Acr/Bis:20~40   完全透明且有弹性;
         <10    很脆,易碎,不透明;
         >100   糊状不成形,易破碎
常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶
交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。
C=b/(a+b)×100%
电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 
分离原理
(一)蛋白质分子的解聚
    样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的金钻脚轮电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(molecular mass of polypeptides ),而电荷因素可以被忽略。
1、SDS
   阴离子去污剂(anionic detergent )
   变性剂(denaturant)
   助溶性试剂 
    断裂分子内和分子间的氢键(hydrogen bond)
    分子去折叠
    破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂
   巯基乙醇(β-mercaptoethanal)
   
   二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT) 
   使半胱氨酸残基之间的二硫键(disulfide bond)断裂。
 SDS和还原剂的作用:
(1)分子被解聚
(2)氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负  
     电荷的蛋白质-SDS胶束。
(3)蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超   
     过了蛋白质分子原有的电荷量,消除
     了不同分子之间原有的电荷差异。
去污剂的选择
无离子去污剂:Lubro W;Brij35, Tween    
              Triton
阳离子去污剂:cetyltrimethyl ammonium 
              bromide (CTAB)
              cetylpyyridinium (CPC)
阴离子去污剂:SDS   deoxycholate
金钻脚轮电泳过程中的不正常现象
(1)“微笑”现象
    指示剂前沿呈现两边向上的曲线形,说明凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好。
2)“皱眉”现象
    由于垂直金钻脚轮电泳槽的装置不合适引起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。
(3)“拖尾”现象
     样品溶解不佳引起。
(4)“纹理”现象
由于样品中的不溶颗粒引起的。
(5)偏斜现象
    电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起
(6)带太宽
     加样量太多或加样孔泄漏引起
分子量测定
1、相对迁移率(relative mobility ,Rf)
  Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。
  测量位置应在蛋白带的中央。 
      蛋白带迁移距离
Rf=  ————————
      溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离      固定前的凝胶长度
   Rf= ————————— X  —————————    
     干燥后的凝胶长度      溴酚蓝迁移距离
2、作图
   以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标,Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值,便可在标   
   准曲线上读出他的分子量
5.等电聚焦金钻脚轮电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis, IEFE 
等电聚焦金钻脚轮电泳(IEFE)是一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电(PI)不同的蛋白质的金钻脚轮电泳技术。
原理:    在金钻脚轮电泳介质中加入载体两性电解质,通电后,两性电解质会逐渐形成一个由正极到负极递增的pH梯度,在此体系中,不同的蛋白质移动并聚焦于与其等电点相当的pH位置。
理想的载体两性电解质应具备的特征
①化学性质稳定;
②分子量要小
→以便与被分离大分子物质分离;
③各成分的pI彼此接近,并在其pI值附近有良好的缓冲能力
→梯度稳定;
④两性电解质载体的数目要足够多
→梯度平滑 ;
⑤对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度
→不影响测定。
优点: 
 分辨率高(可达0.01pH单位);
 灵敏度高(最低检出量达0.1ng);
 金钻脚轮电泳区带狭窄;
 重复性好。
缺点: 
 要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀; 
 由于样品中的成分会停留在其pI,不适用在pI不溶的蛋白质。
IEFE应用 
 1.分析分离制备蛋白质、多肽 
 ①区分人血清蛋白 
 ②测出异常免疫球蛋白 
 ③基因分型 
 ④csf中寡克隆区带的检测 
 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 
 3.双相金钻脚轮电泳中,IEFE作为第一相
 



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